文献解读 | UVB驱使人类皮肤角质形成细胞的代谢重组和表观遗传学重编程而萝卜硫素治疗UVB造成的皮肤损伤

紫外线A(UVA: 315−400 nm)和紫外线B(UVB: 280−315 nm)作为化学因素，会诱发包括黑色素瘤在内的皮肤肿瘤的发生发展。目前研究表明表观遗传学修饰可以调节体内ROS稳态。过于研究证明了ROS调控会影响黑色素瘤在内的各种癌症的发展和转移。

本文课题组过去研究表明，长期UVB照射可以改变SKH-1小鼠表皮组织的DNA CpG的甲基化状态，该甲基化改变会影响癌症相关通路，包括：PTEN、p53、Nrf2和炎症通路的信号传导。然而，紫外线辐射所诱发的皮肤肿瘤，其发生的机制当前仍然不清楚，其对应的表观遗传的调控尚不明晰。

MC-seq，RNA-seq，LC-MS

在这项研究中，本文使用液相色谱-质谱(LC-MS)、DNA甲基化测序和RNA测序检测了暴露于UVB的HaCaT细胞(人类角质形成细胞系)的分子改变；同时设计萝卜硫素(Sulforaphane, SFN)处理组，考察SFN对UVB皮肤损伤的治疗作用。

UVB会驱动角质形成细胞产生代谢重组、表观遗传学重编程和转录组改变；而SFN会阻断或减弱许多这些畸变。表明SFN对UVB诱导的皮肤损伤的整体保护作用。

1. 构建UVB长期诱导的HaCaT分株并检测其整体特征

本文为了研究检测SFN治疗对UVB暴露后的代谢重编。实验用HaCaT细胞株设计了3个模型组，分别为：短期处理组：UVB_3h（10 mJ/cm2紫外线照射后3小时）、UVB_6h（10 mJ/cm2UVB照射后6小时）；长期处理组10wk-UVB HaCaT（10 mJ//cm2紫外线照射每周一次，持续10周）。基于短期和长期的分组，再考察SFN对代谢组的影响。主成分分析（PCA）显示，10wk-UVB HaCaT分株(UVB长期处理组)的代谢产物和短期诱导的分组差异显著，而SFN处理也会导致显著的代谢物差异。为了研究SFN处理或UVB长期照射对HaCaT细胞中基因表达谱改变的影响，设计应用转录组测序进行检测。PCA分析显示，分组间差异显著。

2. UVB及SFN诱导HaCaT细胞的代谢变化

基于差异的代谢物分析富集的通路，UVB短期暴露后改变的代谢产物主要影响：精氨酸和脯氨酸代谢、柠檬酸循环、嘌呤代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭、尿素循环以及氨循环；UVB长期暴露后改变的代谢产物主要影响乳糖合成、淀粉和蔗糖代谢、核苷酸糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解。

SFN处理后也分析了富集的功能和通路，结果显示SFN处理10wk-UVB HaCaT细胞后，变化的代谢产物主要影响磷脂酰胆碱生物合成、雌酮代谢、淀粉和蔗糖代谢以及心磷脂生物合成。有趣的是，结果发现一些UVB调节的代谢产物可以被SFN逆转。代谢物如：N-乙酰基亮氨酸、次黄嘌呤、3-甲基-2-氧代戊酸酯和肌酸被UVB激活，但SFN处理后被抑制。代谢产物如精氨酸琥珀酸盐、脯氨酸和天冬酰胺被UVB抑制，但SFN处理后会重新激活。

3. SFN和UVB可引起HaCaT细胞转录组改变，SFN可逆转UVB引起的转录组改变

针对HaCaT细胞株设计SFN处理组和DMSO对照组。根据差异基因进行富集分析，结果显示SFN激活“氧化还原稳态”和“炎症相关”的通路，包括：NRF2介导的氧化应激反应、IL-6信号传导和神经炎症信号传导。“免疫通路”同样被SFN激活，如Toll样受体信号和TREM1信号；而CD40信号则被SFN抑制。

针对HaCaT细胞株设计UVB长期诱导组(10wk-UVB HaCaT)和对照组。对照组相比，10wk UVB-HaCaT细胞的NF-κB信号和TGF-β信号上调。结果表明，UVB长期诱导会激活“光老化”及“光致癌相关”的反应，如；基质金属蛋白酶(MMPs)、肿瘤微环境途径和HIF1α氧化还原信号。

基于构建的10wk-UVB HaCaT分株，考察SFN的调控作用。UVB处理后会抑制一些功能通路包括：骨关节炎通路、STAT3通路、心肌肥大信号通路（增强作用）、MMP酶的抑制作用等；而SFN处理后该抑制被解除。UVB处理同时也会激活一些功能通路包括：大肠癌癌症转移通路、HOTIAR调节途径和固有凝血酶原激活途径；但SFN处理后该激活效果被抑制。除此之外，MMP1、MMP10、MMP12、MMP13和MMP16这些基因都被UVB激活，但在SFN处理后激活的作用也同样被抑制。

4. SFN处理10wk-UVB HaCaT引起DNA甲基化的变化

为了研究表观对机制的参与，设计进行了DNA甲基测序，以研究UVB诱导和SFN处理是否会改变DNA CpG的甲基化特征。结果显示启动子区域包含大量差异甲基化区域(DMRs)。从整体分布考察，启动子区域的平均甲基化水平低于其他区域。在10wk-UVB HaCaT细胞中，SFN处理组共逆转了18个DMR，这18个DMR相关基因包括ALOX15(15-脂氧合酶-1)、ZNF765(锌指蛋白765)、OR13C8(嗅觉受体家族13亚家族C成员8)、MIR4288(小RNA 4288)和CDHR1(钙粘蛋白相关家族成员1)。

5. CpG甲基化、RNA表达和代谢物之间的相关性。

首先通过四象限图展示DMRs和基因表达的关系，结果显示个别基因在UVB+SFN与UVB分组中存在反比的调控关系。其次通过“基因-代谢物”相互作用网络分析，可视化功能相关代谢物和基因之间的相互作用。UVB诱导的DEGs其下游产生的代谢产物主要为三磷酸腺苷和ADP；而在UVB+SFN组中，受SFN调节的DEGs其下游产生的代谢产物主要为一磷酸腺苷和5′-二磷酸尿苷。

为了研究代谢和表观遗传学过程之间的相互作用，实验最后研究了SFN和UVB对特定代谢产物、DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰酶的影响。本文发现，SFN处理和UVB照射6小时增加了正常HaCaT细胞中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和SAM/SAH(S-腺苷同型半胱氨酸，SAH)的比例。SFN和UVB刺激均增加了ATP水平，而SFN增加了ATP与ADP的比例。SFN显著下调DNMT3B(甲基化转移酶)的表达。10wk -UVB可以使HDAC5(组蛋白去乙酰酶)和SIRT7(组蛋白去乙酰酶)的表达下调，但使HDAC9和SIRT5表达上调。SFN显著下调HDAC6和HDAC11的表达，上调HDAC9和SIRT1的表达。这些都表明UVB和SFN会调控组蛋白的修饰酶表达从而实现对下游基因表达和代谢物的调控。

参考文献：

Li S, Dina Kuo HC, Wang L, Wu R, Sargsyan D, Kong AN. UVB Drives Metabolic Rewiring and Epigenetic Reprograming and Protection by Sulforaphane in Human Skin Keratinocytes. Chem Res Toxicol. 2022;35(7):1220-1233. doi:10.1021/acs.chemrestox.1c00432