临床样本单细胞悬液制备方案|单细胞转录组学揭示肺部微浸润性腺癌的分子特征与恶性潜能：揭开其无症状的表象

肺腺癌（LUAD）的发展被认为是从原位腺癌进展到微创腺癌（MIA），最终发展到完全浸润性腺癌（IA）的。由于MIA的惰性生长模式和良好预后，手术切除被认为是治疗MIA的首选。随着靶向治疗和免疫疗法的发展，使癌症死亡率进一步降低成为可能。然而，这些疗法对MIA的疗效尚不确定，目前它们不是治疗MIA的首选。这突显了解码MIA分子性质的紧迫性，为这些治疗提供合理的支持。

同时，有研究指出肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）的异质性在塑造肿瘤行为中起着至关重要的作用。因此，解码MIA中肿瘤细胞与TME之间复杂的相互作用对于更好地了解维持MIA惰性本质和促进肿瘤进展的机制至关重要。

随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现，已有研究已经揭示了MIA和IA之间癌细胞和肿瘤微环境（TME）转录组的显著差异，但由于患者之间的巨大差异，研究结果仍然存在不一致。这种现象的主要原因在于LUAD的进展受到多种因素的影响，包括遗传和表观遗传特征、环境暴露、生活方式习惯、整体健康状况等等。因此，本研究旨在消除这些混淆变量，探索 MIA肿瘤细胞性质，揭示TEM在其中的影响，从而为MIA和LUAD的治疗发展提供新的生物学基础。

1. 对MIA和IA的肿瘤和免疫生态系统的scRNA-seq分析

本研究收集了三名未经治疗的原发性LUAD患者的MIA和IA标本以及非肿瘤组织（N）和PBMC样本，用于scRNA-seq。通过Seurat进行细胞分类和标记基因鉴定，并用UMAP方法进行了可视化，研究者将这些组织中的细胞簇归类到了10个主要的已知细胞谱系中，包括单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞、T细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、B细胞、树突状细胞（DC）、中性粒细胞和肥大细胞。从中发现，非免疫细胞的比例，主要包括上皮细胞粘附分子+ （EpCAM+）上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞，从N到MIA和IA样本逐渐增加。其中，MIA中的非免疫细胞主要是内皮细胞（76%），而在IA中，它们大多是恶性上皮细胞（97%）。而免疫细胞的比例，MIA和N中分布相当，主要包括单核细胞/巨噬细胞、NK细胞和T细胞。但在IA内部，单核细胞/巨噬细胞的比率超过了前者两个，而NK细胞的比率有所下降。此外，与前三种组织相比，PBMC显示出免疫细胞组成很独特，主要是由T细胞组成。

为了深入了解不同阶段LUAD之间的分子变异，研究还对N、MIA和IA组织之间的基因表达谱进行了比较。结果发现，MIA与N之间差异表达基因（DEG）的数量与IA与MIA之间以及IA与N之间DEG的数量相比显著减少。这表明MIA的基因表达谱更像N，而不是IA。此外，与N相比，在IA中上调的DEG主要存在于上皮细胞和内皮细胞中，而在MIA中上调的DEG主要存在于成纤维细胞中。以上结果表明，MIA和非肿瘤组织（N）具有相似的免疫生态系统，但与IA有着明显的区别。

2. MIA恶性细胞的标志性特征的探索

接下来，研究者重点关注了N、MIA和IA组织中上皮细胞的转录组特征。通过比较它们的拷贝数变异（CNVs），可以发现MIA组织的CNV较低，表明MIA组织尚未完全表现出恶性特征。另外，又根据它们的主要标记基因将正常细胞簇分为5种不同的正常细胞类型：肺泡I型细胞（AT1）、Club/Clara细胞、肺泡II型细胞（AT2）、纤毛气道上皮细胞（Ciliated）和基底细胞（Basal）。从中可以发现，正常细胞簇在患者之间是共享的，而恶性细胞簇则随着患者的不同而变化，这突显了恶性细胞特有的跨患者异质性。同时也可看出，源于MIA的细胞的转录组特征与源于正常组织的细胞更相似，而和源于IA的细胞差别较大。MIA的恶性细胞数量相对有限，主要由两个细胞簇组成：乙醛脱氢酶3家族成员A1+（ALDH3A1+，C3）和补体C1q A链+（C1QA+，C15）细胞，这些细胞簇参与抗原处理和呈递。相比之下，在IA中没有出现主要的恶性细胞簇。此外，这些不同恶性细胞簇的生物过程和信号通路表现出显著的差异。

接下来，研究者利用Monocle3的分析发现恶性细胞可能来自AT1、AT2和基底细胞。这三种细胞类型虽然起源不同，但在恶性肿瘤的后期过程中却有着相似的演变路径。同时，从中也发现了一个介于基底细胞和恶性细胞之间的中间细胞状态，它仅由来自MIA的细胞组成。这个亚簇包括来自不同患者的细胞，因此可以排除潜在的跨患者异质性对演变路径的影响。根据它们的拟时序，这些上皮细胞被分为九个阶段，其中与MIA特异阶段相关（第2阶段）的独特标记物也通过 “‘FindAllMarkers”’函数被分析确定了，分别为水通道蛋白1（AQP1）和血管紧张素II受体类型2（AGTR2）。与IA和N相比，这些基因在MIA上皮细胞中的表达显著增加。通过调查AQP1和AGTR2在该研究scRNA-seq数据和一项公开的scRNA-seq数据中所有细胞类型的表达，可以发现几乎所有同时表达AQP1和AGTR2的细胞都属于上皮细胞。此外，这种高表达主要见于来自MIA样本的细胞。这说明，AQP1和AGTR2的组合能够有效地将MIA细胞与IA细胞区分开来。随后，研究者试图将这两个标记物应用于来自The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的LUAD队列，以区分具有MIA特征的肺癌患者与其他患者。结果发现，这两个标记物成对共表达，并且其表达水平呈正相关。而且，高AQP1表达（AQP1+）和AGTR2表达(AGTR+)的患者比例在LUAD的T1阶段比晚期（T4）显著更高，这表明AQP1+AGTR2+的组合具有区分LUAD患者早期和晚期的高能力。此外，我们将T1阶段中高AQP1+AGTR2+表达的患者定义为具有MIA特征的患者，发现他们与其他阶段的患者相比具有更高的生存概率。研究者还用IF染色，测量了队列中EpCAM+细胞中AQP1+和AGTR2+细胞的比例，发现EPCAM+细胞中AQP1+、AGTR2+和AQP1+AGTR2+细胞的比例显著高于N和IA。以上结果表明，将AQP1和AGTR2的组合作为为MIA恶性细胞的标志特征，能够精确地区分MIA和IA。

3. MIA 中被证实存在丰富的(GZMK)+ CD8+ T 细胞

研究者对T细胞进行了无监督聚类，确定了13个子簇，并发现它们在患者之间以及IA、MIA、N和PBMC样本内都是一致的。同时，结果表明，在MIA的癌前阶段，LUAD微环境中缺乏成熟和功能性的CD4+ T细胞。此外，PBMC显示出CD4+ T细胞亚群的不同组成，与前三种组织明显不同。MIA样本中CD8+ T细胞的比例与正常样本相当，而IA样本中CD8+ T细胞的比例低于MIA和正常样本。此外，IA样本中CD4+细胞毒性T细胞的比例也低于MIA和正常样本，表明MIA的微环境具有足够的细胞毒性，而IA的微环境的细胞毒性已经衰竭。为了进一步研究MIA和IA样本中CD8+ T细胞的转录特征，研究者又比较了正常、MIA和IA样本中CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的基因表达。DEG分析显示，与MIA和正常相比，IA中的许多基因上调，而与IA和正常相比，MIA中只有少量基因上调。KEGG分析显示，MIA中的CD8+ CTL的特征是细胞毒性、P53和NF-κB信号通路的上调，表明这些细胞在MIA微环境中功能良好。

拟时序分析表明，CD8+ T细胞起源于幼稚CD8+ T细胞，共享相同的转变轨迹，但在PBMC、N、MIA和IA样本中处于不同的状态。PBMC中的CD8+ T细胞处于轨迹的开始，其次是来自MIA的一部分CD8+ T细胞和来自N的所有CD8+ T细胞。同时，IA中的CD8+ T细胞处于晚期状态，而MIA中的一些CD8+ T细胞处于轨迹的末端。细胞毒性和衰竭评分显示，过渡始于幼稚CD8+T细胞，然后通过以高细胞毒性和低耗竭为特征的中间状态，最后达到以高衰竭和低细胞毒性为特征的状态。另外，细胞毒性标志物GZMK的表达直到轨迹结束时才增加，这表明在MIA中存在一种特定的衰老CD8+T细胞亚群，其细胞毒性低但GZMK表达高（CytolowGZMK+），其比例明显高于N、IA和PBMC中的比例。研究者后续又使用干扰素，确认了组织中CD8+ T细胞中GZMK+细胞的比例，证实相较于N和IA，MIA中更高丰度的GZMK+ CD8+ T细胞亚群。以上结果表明，CD8+ T细胞的数量和细胞毒性能力随着LUAD的进展而降低，MIA中的CD8+ T细胞由功能性T细胞和功能失调的低细胞毒性GZMK+衰老亚群组成。

高表达的组织蛋白酶B（CTSB）+肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是LUAD MIA阶段的早期应答者

scRNA-seq数据表明，单核细胞/巨噬细胞是LUAD中最丰富的免疫细胞之一。伪时序分析显示，来自N、MIA和IA的单核细胞/巨噬细胞在早期和中期阶段遵循类似的转变轨迹，但来自N和IA的巨噬细胞的转变轨迹在晚期阶段出现分歧，而MIA的转变轨迹介于上述两者之间。这表明MIA巨噬细胞具有双重进化潜力。然后，GO分析进一步表明，MIA阶段成熟巨噬细胞的功能与N阶段相似，但与IA阶段不同。这表明N和MIA中成熟巨噬细胞之间的相似性比MIA和IA中成熟巨噬细胞之间的相似性更接近。

另外，研究确定了巨噬细胞中期的两种关键类型的TAM。其中一种TAM以分泌型磷蛋白1（SPP1）的高表达为特征，被称为SPP1+ TAM，而另一种以CTSB的高表达为特征，被称为CTSB+ TAM。GO分析表明，SPP1+TAM的功能主要集中在抗原呈递上，而CTSB+TAM主要参与激活细胞外信号调节激酶通路。IA 中 SPP1+ TAM 细胞的比例高于 N，但 MIA 中 SPP1+ TAM 细胞的比例并不高于 N。相比之下，IA 和 MIA 中 CTSB+ TAM 细胞的比例均显著高于 N，表明 CTSB+ TAM 细胞而非 SPP1+ TAM 细胞在 MIA 中起着至关重要的作用。经Gyorffy校正的719例LUAD患者的综合数据集显示，CTSB和SPP1的高表达水平与较差的生存率显著相关，突出了CTSB+和SPP1+ TAM在LUAD进展中的关键作用。后续进一步的免疫荧光实验，证实了MIA和IA中CTSB+ CD68+巨噬细胞亚群的高丰度，而在N中则没有。由此可知， MIA中CTSB+ TAM被激活，而SPP1+ TAM未被激活，这可能在LUAD早期进展中起关键作用。

4. CTSB+ TAMs在MIA中表现出与CD8+细胞毒性T细胞的潜在相互作用

为了探究MIA中上皮细胞、T细胞亚群和TAM之间的特定细胞间相互作用，本研究采用了配体-受体相互作用工具CellChat推断信号通路。结果发现， CTSB+和SPP1+ TAM在IA和MIA中都有很强的相互作用。而与IA不同，在MIA中，CTSB+ TAM的相互作用强度强于SPP1+ TAM，表明CTSB+ TAM在MIA起着更关键的作用。上皮本身以及SPP1+ TAM与上皮之间的相互作用在IA中很强，但在N的所有细胞类型之间都很平衡。在CD8+ CTL内以及CTSB+ TAM与CD8+ CTL之间可以观察到SPP1+ TAM之间的强相互作用。

为了确认与CD8+CTL相关的特定信号变化，后续研究比较了CD8+CTL和其他细胞类型之间每对配体-受体之间的相互作用强度。我结果表明，主要组织相容性复合物I（MHC-I）在MIA中的相互作用强度明显强于IA和N。由CTSB+TAM和SPP1+TAM表达的MHC-I配体和受体在MIA中比IA和N中更丰富。基于以上结果可知，随着CTSB+TAM和CD8+CTL之间相互作用强度和相互作用频率的增加，MIA中CTSB+TAM的也会增加。因此，CTSB+TAM可能是MIA中CD8+CTL活化的原因。

本文通过使用来自同步多原发LUAD患者的MIA和IA样本，提供了MIA和IA之间肿瘤生态系统联系和异质性的新证据。研究发现，与MIA和IA相比，PBMC内细胞群的亚型和数量存在显着差异。因此，使用PBMC样本在临床环境中评估LUAD的可行性仍需要进一步调查和评估。另外，研究确认了免疫和肿瘤表型的差异，包括细胞类型和比例、癌症细胞的独特特征、T细胞和巨噬细胞的发育轨迹，以及肿瘤和免疫细胞之间的串扰。MIA肿瘤细胞表现出AQP1和AGTR2的高表达以及基底样分子特征。同时，在MIA中，CTSB+ TAM可能会过度激活CD8+ T细胞，导致GZMK+衰老CD8+ T细胞富集，表明MIA的惰性外观下可能存在恶性进展。这些数据可以成为理论依据，加深对维持MIA惰性特征和促进肿瘤进展的机制的理解，并协助开发更有效的治疗靶点和策略，以治疗MIA患者。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202303753