文献解读 | 阿尔茨海默病脑血管系统的单核多区转录组分析

脑血管失调是阿尔茨海默病(AD)的一个标志，但发生在特定细胞类型的变化尚未完全确定。本文分析了220名AD患者和208名年龄匹配的对照者的6个大脑区域的人类脑血管系统中的snRNA-seq。注释了22,514个脑血管细胞，包括内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、血管周围成纤维细胞和室管膜细胞。鉴定出2676个AD差异表达基因，包括周细胞中PDGFRB的下调，内皮细胞中ABCB1和ATP10A的下调，并验证了死后AD脑组织中SLC6A1的下调和APOD、INSR和COL4A1的上调。检测到血管、神经胶质和神经元共表达的基因模块，提示AD中神经血管单位的协调失调。

与AD遗传学的整合揭示了125个AD差异表达基因与AD相关的遗传变异直接相关。最后，发现APOE4基因型相关差异在毛细血管和小静脉内皮细胞以及周细胞和成纤维细胞亚群中的AD相关基因中显著富集。

snRNA-seq

1. 横跨六个脑区的脑血管特征

对阿尔茨海默病（AD）患者和对照组的六个大脑区域的脑血管进行了snRNA-seq，以发现人类脑血管细胞及其转录组差异。共检测了22,514个单个核的转录组，并注释了11种血管细胞类型，包括内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、血管周细胞和成纤维细胞等。还发现了在动脉、毛细血管和静脉内皮细胞、动脉和静脉平滑肌细胞之间具有不同的转录组特征，并指出了它们在不同血管类型中的特殊功能。

预测了与分子功能和细胞身份相关活动的上游调节因子。发现主要细胞类型共享上游调节因子，但仍然表现出亚型特异性。一些基因在血管内皮细胞中高度富集，如CTNNB1，它通过内皮β-catenin信号通路维持BBB的完整性。对于PER，发现BACH1的富集，这与它通过调节血管生成素-1的表达来进行转录调控是一致的。

接下来评估了血管细胞在大脑区域和表型变量之间是否存在丰度差异。发现在内嗅皮层、海马和丘脑中FIBs的比例显著较高，PERs和cEndo细胞的比例显著较低，这与大脑中小血管的缺乏一致。与这些区域差异相反，血管细胞组分并不随性别、AD病理、年龄或死亡时间间隔（PMI）而不同。检测到的基因数量或捕获的细胞数量与细胞比例之间没有显著的相关性。然而，与血管富集数据集相比，海马和PFC中FIBs （FIB1和FIB2）的比例明显更高、，这表明捕获血管周围样FIBs可能对所使用的技术敏感。

此外，我们发现血管细胞在脑区之间表现出广泛的基因表达差异，其中1,745个基因在两个脑区之间存在差异表达。

2. AD患者细胞类型特异性脑血管改变

为了研究血管基因表达与AD之间的关系，基于单细胞的方法结合不同脑区域所有细胞类型的细胞，在AD患者和对照组之间鉴定了2676个AD DEGs（adDEGs）。通过排列分析，adDEGs的数量显著高于的预期，并在pseudobulk水平得到证。其中，2142个仅为一种细胞类型所特有。值得注意的是，cEndo细胞具有最高数量的adDEGs，cEndo功能中转录差异的重要性与AD病理相关。

其中，细胞连接相关和粘附相关基因，包括APOD、PECAM1和COLEC12；包括SLC38A2、SLC2A1和SLC6A1在内的转运蛋白，以及与固醇输入相关的基因，包括RORA、PRKAA2和PPARG，表明血管细胞类型的这些基本功能可能是AD 中可能存在失调。正如预期的那样， AD样本的PERs中PDGFRB的阳性率，暗示PERAD1,13中BBB完整性的损伤和功能障碍。ABCB1基因在cEndo细胞中明显下调。细胞数量最多的三种细胞类型（cEndo，PER1和FIB1）显示出最大的重叠。

对adDEGs进行GO富集分析表明，多种广泛的功能途径在细胞类型之间是共享的，这表明AD中的转录变化在通路水平上富集到共同的功能；然而，许多途径更具细胞类型特异性。

CD31+血管片段在个体AD中具有较高的INSR1转录密度。发现AD大脑中CD31+内皮细胞的子集具有较高密度的INSR+。这些表明内皮细胞的不同亚群可能表达不同水平的胰岛素受体，使细胞对胰岛素信号的敏感性增强或减弱。编码高密度脂蛋白（HDL）成分的APOD在AD壁细胞中上调，这与以前报道的APOD在AD中的上调一致。为了验证AD PER中APOD的上调，使用原位杂交定量GRM8标记细胞中的APOD转录丰度，并观察到在患有AD的个体中GRM8+ PERs具有较高的APOD表达。PER中APOD上调的功能后果以及对神经血管单元内脂质转运的影响将成为未来研究的基础。此外，验证了SLC6A1在AD PER中的下调，以及COL4A1在AD的血管内皮细胞中的上调。

3. AD中DEGs的上游调控因子

鉴定了118个上调adDEG的上游调节因子和81个下调adDEG的上游调节因子，其中66个靶向各种细胞类型中上调和下调的adDEG。这133个调节因子中有17个是相应的差异表达基因。当这些调节因子显示出目标基因的显著共享时，定义为共调节模块（定义为tfModules）。对于cEndo中上调的adDEG，鉴定了7个tfModule，包括38个调节因子，以及11个不在tfModules中的调节因子。同一tfModule中的调节因子通常具有相关功能。 在每个tfModule中，调节因子具有各自靶基因数量、在AD中的差异表达以及靶基因的差异表达。并非每个tfModule中的所有调节因子都是DEG，这表明一些调节因子可能通过与差异表达的调节因子的协作发挥作用。

使用这些tfModules将目标adDEG分为由不同tfModule组合介导的亚组。对于cEndo上调的adDEG，发现由单一tfModule靶向的群体和其他由多个tfModules靶向的群体，具有独特的共同功能富集。相反，G1中的adDEG是由大多数tfModules（M1-M4、M6）的调节因子靶向的，并显著富集在细胞因子反应、细胞粘附和转录调控中。几个群体中的基因（G3、G7、G8）富集在抑制内皮细胞增殖和凋亡信号通路的表达上，这表明在AD中存在内皮细胞损伤反应，这与BBB破坏一致。

4. AD细胞间通讯动力学

通过分析跨越409个个体的基因模块（定义为degModules）的协变分析，预测了细胞之间的双向通信。发现了301个在AD中上调的相互作用，其中相互作用的degModules在AD中均显示上调。来自PER1和cEndo细胞到神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞的通信在AD中占主导地位，而来自星形胶质细胞和神经元到cEndo细胞和FIB1s的通信在AD中主要减少。

为了表征这种差异细胞间通信的配体-受体信号通路，将由相同配体-受体对介导的单个相互作用聚集起来。TGFβ、SPP1、BMP、ANGPTL和IL-6介导的信号通路在AD增加的相互作用中显著高表达，而胶原蛋白和层粘连蛋白是形成BBB基底膜的主要细胞外基质（ECM）蛋白，其在AD减少的相互作用中高表达，这表明AD中BBB结构被破坏。

排列测试发现大多数双向细胞间相互作用的变化在AD中每种细胞类型对之间都是显著的，这表明AD中失调的基因与多细胞相互作用高度相关。接下来，将每个细胞类型对之间的双向AD差异细胞间相互作用分为正向和反向方向，并对它们进行了量化。cEndo和PER1细胞以及兴奋性神经元和星形胶质细胞之间的相互作用最多。为三个细胞-细胞对（cEndo-Ex、cEndo-Astro和PER1-Ex）构建了配体-受体网络，以突出特定的配体-受体信号通路。BMP6介导PERs（PER1）和兴奋性神经元（Ex）之间AD增加的相互作用，表明其在PER中控制神经发生受损的作用。星形胶质细胞和cEndo细胞之间由表皮生长因子（EGF）信号通路介导的AD减少的相互作用表明，在AD中抑制了cEndo的增殖。

5. AD全基因组关联研究基因座与脑血管病相关

将AD相关的位点与adDEG整合在一起，以预测其候选靶基因和作用方向，其作用的细胞类型以及它们可以直接或间接导致血管基因表达变化的机制。197个AD相关变异位于113个位点，它们接近125个血管adDEG，显示出细胞类型特异性表达变化。大多数adDEG在其内含子（54.3%）或紧邻上游或下游且无介入基因（7.13%）中携带AD相关变异，或者根据不同证据相互关联。这些AD相关的adDEG富集在多个过程中，包括胆固醇运输、调节内皮细胞迁移和IL-6介导的信号。21个GWAS位点与脂质和胆固醇代谢adDEG基因相关联，这与AD中广泛失调的脑胆固醇稳态是一致的。

9个AD GWAS位点与免疫反应、胰岛素分泌和神经退行性病变有关，包括IL6和IL6R，它们在AD患者的cEndo细胞中高表达，提示内皮细胞的免疫反应可能是AD血管的一个突出特征。

寻找间接遗传证据以证明血管adDEG的上游调节器直接与AD相关变异（转录调控）相关联。使用了之前注释的相关模块对（degModules），并搜索了AD相关遗传位点的adDEG配体，以寻找潜在的遗传效应。发现了54对（24个上调和30个下调在AD中），其配体靠近AD相关遗传位点，涉及611个与12个AD相关配体和13个受体（18个不同的配体-受体对）相关联的血管adDEG。这12个AD相关配体代表了比预期更显著的富集。其中7个配体显示了单细胞表达数量性状位点（sc-eQTL）连接证据，3个显示了组织水平脑eQTL证据，7个显示了Hi-C环连接证据。其下游基因至少富集在17种不同的生物学功能中。总之，使用顺式、转录或细胞间信号调节机制，AD中的2676个血管adDEG中有1010个可以与AD遗传关联。这表明遗传风险因素对脑血管的影响可能有助于AD的发病机制，这是通过脑血管细胞类型和大脑实质神经、胶质和巨噬细胞以及外周血中的免疫细胞的细胞内功能障碍和细胞间通讯实现的。

6. APOE基因型与血管细胞认知功能下降

2482个apoeDEG在细胞类型中的分布大体均衡（平均而言，120个APOE4上调和120个APOE4下调），并且数量与adDEG相似。虽然只有中位数为4%的APOE差异基因与AD差异基因重叠，但apoeDEG与adDEG之间的重叠对于一些细胞类型来说具有重要意义。对于cEndo细胞，36%的apoeDEG上调基因也是adDEG上调基因，21%的apoeDEG下调基因也是adDEG下调基因。FIB1和PER1细胞中发现了强有力的apoeDEG-adDEG一致性（十倍至十四倍富集），而PER2和vEndo上调基因的一致性较弱（六倍至八倍）。

搜索了每个细胞类型中上调和下调的apoeDEG所富集的生物学途径。在cEndo细胞中，下调的apoeDEG（E4-down）显着富集在跨BBB运输、细胞连接组织以及调节芽生血管生成中。在PERs中，下调的apoeDEG富集在细胞迁移调节、跨BBB运输以及细胞-细胞连接维持中，这与APOE ε4个体表现出脑血流量减少和脑血管异常增加的报道一致。评估了所有apoeDEG与认知衰退的相关性，发现上调的apoeDEG（E4-up）与所有细胞类型的认知衰退相关，而下调的apoeDEG（E4-down）主要与认知恢复相关。这种效果在cEndo、vEndo、FIB1和PER1细胞中最为明显，E4-up和E4-down基因在认知衰退相关性方面存在实质性和高度显著差异。结果与之前的研究结果一致，cPERs可能介导APOE4对认知衰退的影响，并表明cEndo和FIB1细胞可能具有同等甚至更重要的作用。

进一步鉴定了APOE基因型条件性的、与认知衰退相关的差异表达基因（cogDEG），区分了‘认知衰退上调’cogDEG和‘认知衰退下调’cogDEG。前者与认知衰退呈正相关，后者与认知衰退呈负相关。APOE4个体比APOE3个体表现出更多的cogDEG（超过1.5倍），特别是在cEndo、vEndo、PER1和FIB1细胞中，尤其对于认知衰退上调基因（2.1倍），这表明特定的脑血管细胞类型可能介导APOE ε4等位基因对认知衰退的贡献。比较APOE3与APOE4 cogDEG，发现这两组基因大部分不同，只有约5%的cogDEG在APOE4和APOE3之间是共同的，这表明ε3和ε4携带者在转录变化和认知衰退的具体机制上存在差异。

为了进一步研究APOE基因型条件性的cogDEG的功能，在毛细血管细胞类型（cEndo和PER1）中对E3特异性的、E4特异性的和E3-E4共享的cogDEG进行了GO富集分析。对于cEndo认知衰退上调的cogDEG，APOE4特异性富集包括脂质和细胞因子反应以及细胞凋亡过程；APOE3富集包括血管运输、细胞迁移的负调节和细胞基质粘附。对于cEndo认知衰退下调的cogDEG，APOE4特异性富集包括血管发育、BMP信号的调节和神经递质转运；APOE3富集包括内皮细胞迁移的正调节和细胞外结构组织。对于PER1认知衰退上调的cogDEG，APOE4特异性富集包括细胞因子反应、细胞-细胞连接组装和细胞凋亡；APOE3富集包括SMC迁移的负调节和Notch信号，以及自噬。对于PER1认知衰退下调的cogDEG，APOE4特异性富集包括BBB相关功能（BBB维持、Notch信号、收缩调节），而APOE3富集包括脂质和化学稳态以及细胞连接组装，这表明APOE ε4依赖的认知衰退可能主要由PER1 PERs介导。

参考文献：

Sun N, Akay LA, Murdock MH, Park Y, Galiana-Melendez F, Bubnys A, Galani K, Mathys H, Jiang X, Ng AP, Bennett DA, Tsai LH, Kellis M. Single-nucleus multiregion transcriptomic analysis of brain vasculature in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2023 Jun;26(6):970-982. doi: 10.1038/s41593-023-01334-3. Epub 2023 Jun 1. Erratum in: Nat Neurosci. 2023 Oct 31;: PMID: 37264161; PMCID: PMC10464935.