文献解读 | CAR-NK细胞治疗后代谢适应性的丧失会导致肿瘤产生耐药性，并且可以通过细胞因子工程来克服

NK细胞是先天性细胞毒性淋巴细胞，不需要抗原呈递即可介导细胞毒性并诱导靶细胞死亡，具有抗肿瘤功能，在癌症的监视和消除中发挥重要作用。其嵌合抗原受体 (CAR) 工程前景广阔，不同于常见抗原嵌合受体T细胞疗法需要使用自体T细胞，NK细胞具有更好的开发通用型疗法的潜力，并且安全性更高，早期临床研究显示出令人鼓舞的反应。然而，人们对输注后控制CAR-NK细胞命运的转录特征以及影响肿瘤控制的因素仍知之甚少。本研究进行了单细胞RNA测序和质谱流式分析，以研究CAR-NK细胞的异质性及其在过继转移后从肿瘤控制阶段到复发阶段的体内进化。

scRNA-Seq、SMART-seq2

1. scRNA-seq揭示了CAR工程后NK细胞的独特表型、功能和代谢特征

研究人员对NK细胞进行基因工程改造，使其表达单独的CAR19、IL-15 和同时表达 CAR19/ IL-15(Fig 1A)。未转导的NK细胞(NT)用作对照，激活、转导和体外扩增，收集 NK细胞用于scRNA-seq测序。结果确定了四个主要簇，与NT-NK细胞相比，每个簇都有不同的工程NK细胞群，其中簇 3包含大部IL-15 和 CAR19/IL-15 NK细胞，簇 1和簇 4是 CAR19和NT-NK细胞中最丰富的簇(Fig 1 B-C)。在簇水平上鉴定上调的差异基因及相应的基因富集途径，结果表明，CAR19-NK细胞主要富集与免疫细胞激活相关的途径，IL-15 和CAR19/IL-15 NK细胞均表现出与DNA复制、细胞分裂、脂肪酸代谢和糖酵解及mTOR 和c-Myc信号传导，从而表明IL-15在NK细胞增殖和有氧糖酵解中发挥作用(Fig 1D-F)。紧接着，研究NK 细胞的代谢潜力，携带cAR19/IL-15 NK细胞显示出其他两组更高的整体代谢活性，胞外酸化率(ECAR)显著增加 (Fig 1G)，并且CAR19/IL-15 NK细胞对Raji细胞产生的更大的细胞毒性，表明CAR介导的激活和IL-15信号传导之间存在协同效应，有助于增强 NK 细胞反应(Fig 1H)。

2. IL-15可改善CAR-NK细胞的持久性并延缓体内功能障碍

为了确定IL-15如何增强体内CAR介导的功能，研究人员在非治愈性Raji淋巴瘤小鼠模型中比较了CAR19、CAR19/IL-15 和 NT-NK 细胞的持久性和抗肿瘤活性(Fig 2A)。接受一剂 CAR19/IL-15 NK 细胞治疗的小鼠的肿瘤负荷显着降低，存活率提高，但是最终还是死于疾病(Fig 2B-E)。最终提出一个假设：尽管IL-15增强了CAR-NK细胞的代谢适应性和抗肿瘤活性，但NK细胞最终会变得功能失调，从而导致肿瘤复发。对不同时间点取样的NK细胞进行拟时序分析。结果表明，在早期时间点簇1是所有处理组的优势簇，其特征是成熟的表型，然而，在第7天过后不同的处理组出现不同的分化轨迹(Fig 2F-G) 。到第14天，NT-NK细胞迅速以第2簇为主，其特征为激活受体(DNAM1等)下调，细胞毒性颗粒减少(Fig 2H)。簇4的特征不仅是抑制标记基因(NKG2A等)高表达、转录因子 (Eomes 、T-bet)和细胞溶解蛋白(GrA)低表达，而且上调细胞因子受体IL-2R(CD25)、干细胞因子受体(c-Kit)和共激活受体(2B4等)(Fig 2H-I)，这与先前激活的表型和最终的衰竭相一致。为了评估AR19/IL-15 NK细胞在体内进化的效力，从小鼠体内分离纯化人的NK细胞 ，第35天cAR19/IL-15 NK细胞显示细胞毒功能严重受损，不能杀伤K562和Raji肿瘤细胞(Fig 2J)，验证了之前的假设。

3. NK细胞与体内肿瘤的协同进化

为了解与治疗耐药性相关的机制，取输注后的多个时间点的动物骨髓中分选纯化NK细胞和 Raji 肿瘤细胞，并进行 scRNA-seq 测序，输注前的NK细胞与输注后的NK细胞在转录谱方面有所不同(Fig 3A)。分析显示，第7天，NK细胞簇5在CAR19/IL-15 NK组中占绝对优势，第 21 天开始减少，N7在第21天为主要簇(Fig 3B-C)。进一步对 NK 细胞簇的 DEG和相应的富集途径进行了分析，结果表明簇5的NK细胞大多表达与免疫功能相关的标志性途径、DNA 复制等(Fig 3E)。还对各类NK细胞进行细胞的激活、抑制、功能和代谢的基因随时间的动态变化活性评分(Fig 3G)，数据表明CAR19/IL-15 NK细胞保持了功能表型、代谢适应性和持久性的增加，从而导致细胞活性增强和抗肿瘤反应随着时间的推移而降低，这与肿瘤复发相关。为了研究CAR19/IL-15 NK细胞是否需要肿瘤抗原介导的激活才能持续存在并发挥功能，研究人员行了一项体内研究来测试CAR19/IL-15 NK细胞在存在或不存在肿瘤细胞的情况下的行为(Fig 3H)，结果表明与无肿瘤组相比，CAR19/IL-15 NK细胞在肿瘤存在下表现出更长的持久性和更高的代谢活性(Fig 3I)，并且暴露于肿瘤细胞的CAR-NK细胞包括OXPHOS和脂肪酸代谢在内的代谢途径上调(Fig 3J)。在最初与肿瘤细胞接触时，NK 细胞被激活并表现出增强的功能和代谢。然而，随着时间的推移，NK 细胞可能会变得功能失调，其抗肿瘤反应也会下降。

4. NK细胞代谢适应性丧失而导致肿瘤对CAR-NK细胞治疗产生耐药性

为探索是否可以通过NK细胞和肿瘤细胞之间代谢适应性的相对差异来解释CAR-NK 细胞疗法的耐药性，量化并比较了 Raji淋巴瘤模型NK耐药肿瘤簇(T1、T4)、NK敏感肿瘤簇(T2、T5 、T6)和NK细胞之间标志通路的活性(Fig 4A)。研究表明，糖酵解、脂肪酸代谢、氧化磷酸化途径在所有NK产品检测到肿瘤和 NK 细胞相对应的时间点都显示出更高的活性(Fig 4B)，但两个耐药肿瘤簇 T1 和 T4 具有较高的活性水平(Fig 4C)。最后研究人员还分析了随着时间的推移肿瘤细胞重新出现时每个簇的代谢途径活性的动态情况，所有肿瘤簇在第 7 天都表现出高代谢活性，非功能性NK细胞簇(N6、N7)显示出最低的糖酵解活性，并随着时间的推移保持相对稳定，而功能性NK细胞簇N5在CAR19/IL-15 NK细胞组中占主导地位，但随着时间的推移逐渐降低(Fig 4D)。

5. NK细胞显示出连续的基因表达状态

为更好的了解各细胞簇异质性的程度，对NK细胞进行拟时序分析，确定了输注前和输注后两条轨迹(Fig 5A)。输注后轨迹捕获了具有高代谢适应性和抗肿瘤活性功能性 NK细胞向非功能性 NK细胞的转变即N5至N6(Fig 5B)，描述了NK细胞功能障碍轴。CAR19/IL-15 NK 细胞在接近输注后轨迹开始处表现出细胞富集，并且沿着功能障碍轴细胞进一步减少 (Fig 5C-D)。DEG的功能分析还表明，low-N5细胞表现出参与细胞周期、增殖的基因和代谢相关途径的高表达(Fig 5E)。

6. 通过两次输注改善 CAR-NK 细胞治疗

由于CAR19/IL-15 NK细胞的激活、代谢适应性和功能随着时间的推移而下降，研究人员假设第二次输注将增强功能性NK细胞的数量并巩固反应，从而导致长期长期肿瘤根除。从具有不同人类白细胞抗原 (HLA) 类型的两名捐献者(HLA-A3 、HLA-A2)中生成了 CAR-NK细胞，对间隔两周患有Raji淋巴瘤肿瘤的小鼠进行了两次CAR19/IL-15 NK细胞输注(Fig 6A)，与单次输注或者NT-NK输注相比两次输注CAR19/IL-15的小鼠获得更高生存率 (Fig 6B-D)。为阐明两剂CAR19/IL-15 NK细胞治疗的小鼠存活率提高的机制，研究人员观察到第一次输注的NK细胞 (HLA-A3) 比例在第 14 天最高，但随着时间的推移稳步下降，在第35天几乎检测不到，第一次输注后2周施用的来自第二个供体 (HLA-A2) 的NK细胞是第 35 天的主要细胞来源，并持续到实验的第 61 天(Fig 6E)。通过比较两次输注相隔2周的CAR-NK细胞的表型发现，来自第一次和第二次输注的NK细胞表型相似，但在低肿瘤负荷期间进行第二次输注CAR19/IL-15 NK细胞可能会增加随后的功能性 NK 细胞数量(Fig 6F)。

7. CAR19/IL-15 NK细胞免疫治疗后患者CAR-NK细胞和B细胞的转录谱

从两名诊断为CD19+ 复发的患者多个时间点收集并分析外周血中分离的CAR-NK 细胞和 B 细胞来评估临床结果是否适用于接受CAR19/IL-15 NK细胞治疗，结果显示，患有

CLL的6号患者输注后完全缓解，患有多次复发转化型滤泡性淋巴瘤的10号患者输注后没有反应(Fig 7A)。对荧光激活流式分选纯化的B细胞和NK细胞进行SMART-seq2测序，鉴定了两个细胞簇。簇1包含来自两名患者的NK细胞，簇2为仅来自于10号患者B细胞(Fig 7B-C)。接下来，对两名患者的第7、14天的CAR-NK细胞进行GSEA分析，结果显示两名患者在第7天没有差异表达的通路，但是6号患者表现出与NK细胞活化、趋化因子活性相关的基因(NFKBIZ等)的较高表达(Fig 7D)。这些差异在第14天更明显，6号患者的NK细胞也表现出细胞溶解基因(GZMB、GZMA)和改善NK细胞溶解相关的多种趋化因子基因(CCL3、等)的表达(Fig 7E)。第14天的GSEA分析显示患者6的NK细胞显示出OXPHOS的上调以及同种异体移植排斥反应显著(Fig 7F)，而患者10的NK细胞显示出缺氧信号的上调，也在非功能性小鼠中观察到这一点。总之，有反应患者的CAR-NK细胞可能具有改善的新陈代谢和更高的免疫相关基因表达。

通过基因改造使CAR-NK细胞表达IL-15，可以增强NK细胞的代谢能力，并提供更持久的抗肿瘤反应。此外，与单次输注相比，两次输注表达CAR-NK细胞可提高存活率。

参考文献：

Li L, Mohanty V, Dou J, Huang Y, et al. Loss of metabolic fitness drives tumor resistance after CAR-NK cell therapy and can be overcome by cytokine engineering. Sci Adv. 2023 Jul 28;9(30):eadd6997. doi: 10.1126/sciadv.add6997. Epub 2023 Jul 26. PMID: 37494448; PMCID: PMC10371011.