文献解读 | 单细胞和空间转录组学鉴定到与骨骼肌纤维化相关的巨噬细胞群

巨噬细胞对骨骼肌稳态至关重要，但巨噬细胞功能失调导致肌肉疾病中纤维化的机制尚不清楚。本文使用单细胞测序确定了营养不良和健康肌肉巨噬细胞的分子特征，鉴定到了6个不同于M1和M2的新巨噬细胞群。营养不良肌中的主要巨噬细胞特征是高表达纤维化因子半乳糖凝集素-3（gal-3）和骨桥蛋白（Spp1）。空间转录组学、细胞间通讯分析和体外试验表明，巨噬细胞中Spp1调节基质祖细胞分化，Gal-3⁺巨噬细胞在营养不良肌中被长期激活，过继转移试验表明gal-3⁺表型是在营养不良环境中诱导的显性分子程序。Gal-3⁺巨噬细胞在多种人类肌病中也升高。本文深入研究了巨噬细胞转录图谱，促进了对巨噬细胞在肌肉萎缩症中发病机制的理解，并揭示了Spp1是巨噬细胞和基质祖细胞相互作用的主要调节因子。

单细胞转录组测序，空间转录组测序

1. scRNA-seq揭示骨骼肌巨噬细胞内独特的细胞状态

研究者选取了达到了炎症峰值状态的疾病急性期（4周龄）B10.mdx小鼠后肢肌肉和同龄的C57BL/10野生型（WT）对照小鼠，从中纯化肌肉巨噬细胞（F4/80⁺CD11b⁺SiglecF^-细胞）进行单细胞测序。共检测到11,367个单细胞（WT=5,723；mdx=5,644），过滤掉污染细胞类型，共获得6个巨噬细胞簇。

C0-C5巨噬细胞群的比例在健康和营养不良肌肉中有显著差异。C1几乎只存在于健康肌肉中，而C0和C2主要存在于营养不良肌肉中。C3至C5在健康肌肉和营养不良肌肉之间无明显差别。从营养不良和WT健康肌肉分离的巨噬细胞转录谱存在显著差异。

C1亚群与先前在健康肌肉中发现的骨骼肌常驻巨噬细胞（SkMRM）的亚群有相似之处，因此命名为SkMRM。C0巨噬细胞（简称为gal-3⁺巨噬细胞）高表达Spp1、Lgals3和各种组织蛋白酶基因。而Lgals3（gal-3）和Spp1与纤维化的发展有关，暗示gal-3⁺巨噬细胞在肌营养不良期间促进纤维化。C2(命名为MDM)，是一个类似于Ly6^chiCCR2⁺炎性的单核细胞衍生群体。

2. SkMRM、MDM和gal-3⁺肌肉巨噬细胞的常规转录组分析

研究者通过流式细胞术验证了主要与稳态或营养不良蛋白病相关的巨噬细胞群。作者分别选取Gal-3、Folr2和CD52作为标记物分选Gal3⁺巨噬细胞、SkMRM和MDM，进行常规转录组测序。测序结果显示，3种巨噬细胞的基因表达特征与单细胞数据中的巨噬细胞群一一匹配。

与SkMRM相比，gal-3⁺巨噬细胞和MDM组的差异基因中，参与白细胞活化和炎症反应的基因表达上调，而糖胺聚糖和ECM相关途径中的基因下调。Gal-3⁺巨噬细胞和MDM有各自特异的DEG，表明不同营养不良肌肉巨噬细胞群体的特殊功能状态。肌肉巨噬细胞的转录组学分析支持以高gal-3表达为标志的终末分化状态是肌营养不良诱导的主要特征。这种gal-3信号与ECM的调节有关，并且与M1和M2巨噬细胞激活信号几乎没有重叠。

3. 空间转录组学分析显示gal-3⁺巨噬细胞与基质细胞和ECM基因相关

为深入了解gal-3⁺巨噬细胞如何在功能和空间上与营养不良环境互作。在DBA2/J背景（D2-mdx）中对6周龄mdx小鼠的腓肠肌/跖肌复合体进行空间转录组测序。结果显示，高表达gal-3的区域局限于具有活跃病理的区域，这些区域中单核细胞密集分布。

相比gal-3^lo区域，与ECM和纤维化相关的多个基因在gal-3^hi区域富集，而Lgals3和Spp1是表达量升高最显著的两个基因，分别上调了30倍和25倍以上。血小板衍生生长因子受体(PDGFRA)，在gal-3⁺区域上调。研究者对mdx股四头肌进行的免疫荧光分析，结果显示病理病变中的PDGFRA⁺基质细胞与gal-3⁺巨噬细胞重合，表明gal-3⁺巨噬细胞在退行性病变中与基质细胞（如FAP）相互作用，以促进纤维化。

4. 细胞间通讯网络分析确定FAP和巨噬细胞通过Spp1进行信息交流

为了确定gal-3⁺巨噬细胞和基质祖细胞如何相互作用，研究人员对骨骼肌单核细胞数据集进行了整合，并使用CellChat研究了细胞间通信网络。与结果1类似，gal-3⁺巨噬细胞是营养不良肌肉中的主要巨噬细胞群体，gal-3⁺巨噬细胞中信息交流最频繁，而巨噬细胞和肌腱细胞之间几乎没有信息交流。

鉴于Spp1途径在肌营养不良期间促进肌肉纤维化的已知作用，研究者进一步分析发现，Spp1途径的最高贡献归因于Spp1-CD44配体-受体对。RNAscope与免疫荧光染色复合显示，巨噬细胞和胶原增加的退行性病Spp1表达量升高。gal-3⁺肌肉巨噬细胞的体外培养显示，与骨髓单核细胞相比，它们分泌更高水平的Spp1。单核细胞和gal-3⁺巨噬细胞条件培养基以Spp1依赖的方式诱导FAP中Acta2的表达，但只有gal-3⁺细胞条件培养基增加了Col1a1的表达。以上结果均表明，Spp1通路是肌营养不良期间gal-3⁺巨噬细胞和FAP相互作用的关键调节因子，并且Spp1主要通过CD44发出信号以控制FAP分化。

5. Gal-3⁺巨噬细胞来源于SkMRM和外周单核细胞

研究者通过过继转移实验测定SkMRM和单核细胞分化为gal-3^hiFolr2^lo巨噬细胞的能力。将来自CD45.1⁺先天性WT小鼠的SkMRM或骨髓单核细胞注射到4周mdx.CD45.2⁺受体小鼠的股四头肌中。从WT肌肉转移CD45.1⁺SkMRM导致Folr2下调和gal-3上调，在转移后的第二天类似于gal-3^hiFolr2^lo表型。CD45.1⁺SkMRM在转移后7天显著下降，表明从SkMRM中出现的gal-3^hiFolr2^lo是短暂的。有趣的是，转移到健康WT肌肉中的mdx-gal-3⁺巨噬细胞没有恢复到SkMRM表型，表明在这种情况下，gal-3⁺巨噬细胞几乎没有可塑性。

最后作者通过免疫组织化学等方法，证实gal-3⁺巨噬细胞在人类患病肌肉中同样存在升高现象。

参考文献：

Coulis G, Jaime D, Guerrero-Juarez C, et al (2023) Single-cell and spatial transcriptomics identify a macrophage population associated with skeletal muscle fibrosis. Sci Adv 9:eadd9984. https://doi.org/10.1126/sciadv.add9984