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伯豪生物 | 新药研发 & 疫苗研发整体解决方案
发布时间:2021-08-12 浏览次数:1596
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技术背景

2018 年以来,越来越多的药物研发机构开始注意到单细胞测序技术在药物研发上的优势。首先是通过分析不同病人样本的单细胞图谱来挖掘潜在的靶点(细胞、通路和分子),主要是在 RNA 和蛋白水平上筛选及验证细胞特异性表达的药物靶标。其次,探究病人组织微环境中细胞类型与分子特征的相关性,如靶标与特定的免疫细胞或基质细胞、信号通路、空间位置、受体配体等的相关性,从而更好地确定靶标的作用方式及细胞 - 细胞相互作用。一旦确定了靶点,需将候选模型与病人的单细胞表达谱进行比较,以确定匹配的模型。并且单细胞测序还能用于进一步探究细胞构成及基因表达在用药前后的变化,及治疗有效 / 无效之间的差异,以评估治疗过程及新药物的有效性;此外,对不同药物及其组合进行单细胞测序比较,还可筛选治疗组合。


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为什么 更多科研工作者 选择 伯豪生物单细胞测序技术服务?

2020 年,行业首份《单细胞测序行研报告》系伯豪生物编写、联合出版;

2021 年,Bio-protocol  单细胞测序技术实验方法复现集系伯豪生物联合出版;

●大样本量验证:30 万样本 / 年,伯豪专业技术服务团队实验经验丰富;

●严格质量标准:QA 系统为您实验全程护航,实验严格按照 156 个 SOP 文件进行;

●实验记录完备: 严格的流水线作业项目管理流程,保证所有实验记录可供回溯;

●多重实验质控: 实验室 QC、数据分析 QC、项目管理 QC,3 重 QC 有效减少低质量数据。


伯豪生物 单细胞测序技术 能够应用到哪些领域?

单细胞测序技术以其高通量、高分辨率的特点,使人们开始意识到它在药物研发中的巨大潜力,包括在单细胞水平上进行高通量地药物靶点筛选、药代动力学分析、药效评价等,极大地缩减药物发现周期、节约新药研发成本。单细胞测序技术为新药研发注入新的希望,有助于药物研发机构优化新药研发管线。

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▲驱动药物开发的单细胞测序技术




在临床前或临床试验中,单细胞表达谱的分子分辨率可用于描述联合免疫治疗中潜在的协同、加性、中性或拮抗的细胞和分子活性。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种常对化疗产生耐药性的恶性乳腺癌,这种耐药性是由于化疗对预先存在的克隆的选择还是化疗期间获得了新的基因突变导致是一个长久未解决的问题。为了探究这个问题,科学家们利用单细胞 RNA-seq、单细胞 DNA-seq 和全外显子测序研究了 20 名 TNBC 患者在接受新辅助化疗(NAC)期间的基因及表达变化,相关研究成果 2018 年发表在《Cell》上 [6]


深度外显子测序发现 10 位患者 NAC 导致 clone 消失,而 10 位患者治疗后 clone 一直存在,利用单细胞基因组测序探究拷贝数变异,鉴定耐药基因。对不同治疗时期的肿瘤细胞进行差异表达基因分析发现,所有消退型患者在治疗后 12 个已知的癌症基因均下调,部分信号通路也下调。结合分析肿瘤细胞和正常细胞,发现治疗后正常细胞亚群中 ACTA2 表达水平高,治疗前肿瘤细胞亚群中 EPCAM 表达水平高。探究持续型患者的表型进化,对每个患者进行差异表达分析,仅有少量显著基因(MYC,ERBB3,KIT,PI3KR1)已知与肿瘤相关,但耐药基因在治疗后出现了高度富集。

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▲图 治疗与肿瘤表型进化相关性(消退型患者)[6]

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▲图 治疗与肿瘤表型进化相关性(持续型患者)[6]

引用文献:

[6] Kim C, Gao R, Sei E, et al. Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing[J]. Cell, 2018, 173(4):879-893.



案例 1:病毒疫苗


谢晓亮教授团队利用高通量单细胞 RNA 和 VDJ 测序平台,从 60 位康复期病人身上筛选出 8558 种病毒蛋白结合抗体序列,成功找出 14 株高活性的中和抗体。其中编号为 BD-368- 2 的抗体表现突出,在假病毒实验中的半抑制浓度(IC50)达到 1.2 ng/mL(8pM);在军事医学研究院 P3 实验室进行的真病毒实验中,IC50 达到 15 ng/mL(100pM)。中和抗体体内抗病毒实验进一步证实,利用 hACE2 转基因小鼠模型,感染 SARS-Cov- 2 后给予 BD-368- 2 的治疗使病毒载量下降~2400 倍。而注射 BD-368- 2 后可完全抑制小鼠的病毒感染,达到预防效果。研究团队还利用冷冻电镜得到新冠病毒 Spike 三聚体与中和抗体的高分辨率 3.8Å三维结构密度图。数据显示,抗原上的中和抗体表位与 ACE2 的结合位点重合,从而揭示出中和作用的结构基础。此外,研究人员还证明了可以根据 CDR3H 结构的相似性来选择 SARS-CoV- 2 中和抗体 [7]

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▲图 利用高通量单细胞 RNA 和 VDJ 测序筛选中和抗体


案例 2:病毒疫苗


范德比尔特大学的研究组在 Cell 杂志上发表文章 [8],提出了一种名为 LIBRA-seq 的新的测序技术。作者构建了一个特殊的抗原库,将抗原连接上 DNA 条码和用于流式细胞术分选的荧光标签。接下来,将这个库与富含 B 细胞的样本共孵育。将连有荧光标签的抗原和与之结合的 B 细胞共同分选出来,并进行测序,从而得到 BCR- 抗原序列图谱。利用 LIBRA-seq,研究人员绘制了来自两名 HIV 感染者的数千个 B 细胞的抗原特异性图谱,许多 HIV 和流感特异性抗体的预测特异性得到证实。这项技术可以有效地绘制 BCR 序列及其对应的特异性抗原图谱,在抗体研发和疫苗制备领域具有广泛的应用。

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▲图 LIBRA-seq 及功能验证流程


案例 3:个性化肿瘤疫苗


NeoVax 是一种新抗原(Neoantigen)肿瘤疫苗,主要以新抗原为靶点。新抗原通常是肿瘤细胞在发生发展过程中,随机突变产生的新的蛋白质或多肽,一般特异性表达于肿瘤细胞中但不存在与正常组织细胞中。因此,新抗原也成为了肿瘤免疫治疗的理想靶点。早在 2017 年,美国 Dana Farber 癌症研究所应用 NeoVax 治疗恶性黑色素瘤患者,并取得的良好疗效。6 名高复发风险的患者在术后 18 周开始接受 NeoVax 疫苗治疗。在接种后的 2 年多时间内,4 名患者未发现肿瘤复发;另外 2 名恶性黑色素瘤伴肺转移的患者,在接种疫苗后复发,随即开始接受 PD-1 单抗药物的治疗,也获得完全缓解并处于无疾病进展状态 [9]。为了进一步探究 NeoVax 肿瘤疫苗的远期临床疗效及其机制,研究人员对上述 6 名患者及新入组的 2 名患者进行长期随访。在术后 4 年多(55 个月)的中位数随访中,8 名患者全部存活,其中 3 名患者仍未出现复发。复发的 5 名患者中,2 名 IV 期患者接受 pembrolizumab(PD- 1 单抗)治疗后完全缓解(2017 年已报道),1 名患者接受了手术切除且仍未发现疾病证据(NED),2 名患者发展为不可切除的转移性疾病。

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▲图 新抗原疫苗治疗的黑色素瘤患者的长期临床结果


对于如此令人兴奋的长期临床疗效,研究人员期望揭示患者体内的变化和机制。研究人员首先试图确定 NeoVax 疫苗诱导的特异性 T、细胞在外周血中的功能状态是如何演变的。他们对新抗原特异性 T 细胞,尤其是 CD4+ T 细胞的特征进行了跟踪和分析。结果发现,NeoVax 疫苗诱导的新抗原特异性 CD4+ T 细胞表现出记忆性和细胞毒性特征。进一步分析了这些患者的 T 细胞,发现这些患者体内不仅产生了靶向的目标新抗原的特异性 T 细胞,而且还扩展到识别其他与黑色素瘤相关的新抗原,起到了更强更持久的抗肿瘤效果 [10]

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▲图 抗原特异性 T 细胞的跟踪和分析


引用文献:

[7]. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo, et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’B Cells[J]. Cell, 2020, 182(1):73-84.

[8]. Setliff I, Shiakolas A R, Pilewski K A, et al. High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity[J]. Cell, 2019, 179(7):1636-1646.

[9]. Ott PA, Hu Z, Keskin DB, et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J]. Nature, 2017, 547(7662):217-221.

[10]. Zhuting Hu, Donna E Leet, Rosa L Allesøe, et al. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(3):515-525.

 

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