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Illumina 850k甲基化芯片介绍

Illumina在原450K芯片巨大成功的基础上,推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片(下文中以850K芯片代称),为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。850K芯片可检测人全基因组约853,307个CpG位点的甲基化状态,其中包含了原450K芯片91%的位点,并增加了413,745个位点(图 1)。850K芯片不但保持了对CpG岛,基因启动子区的全面覆盖,还特别加强了增强子区(新增了333,265个探针覆盖来自ENCODE及FANTOM5计划的增强子)以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究,是一款适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。

 

Illumina 850k甲基化芯片特点

  1. 覆盖全面:检测853,307个CpG位点;全面覆盖CpG岛、启动子、编码区及增强子;
  2. 无需“甲基化DNA免疫共沉淀”,亚硫酸氢盐处理基因组DNA即可进行芯片实验; Infinium探针设计,直接识别甲基化位点;
  3. 技术重复重现率>98%;
  4. 操作简单,无须PCR扩增;模板量可低至250ng;
  5. 适用于FFPE样品。

 

Illumina 850k甲基化芯片技术特点

  1. 流程简单,无需进行繁琐的免疫共沉淀;
  2. 单碱基分辨率;
  3. 通量高,可一次性检测8个以上样品;
  4. 全基因组覆盖,对于未知功能区域及增强子同样覆盖;
  5. 只针对人类样本;
  6. 数据准确,与焦磷酸平台吻合度高。

 

Illumina 850k甲基化芯片技术流程

 

Illumina 850k甲基化芯片分析流程

 

Illumina 850k甲基化芯片技术参数

 

案例展示

案例一:《Journal of Clinical Oncology》报道早期肝癌术后复发可预测甲基化位点标记

在全世界分范围内,每年因肝癌死亡的病例超过50万人,是主要的因癌死亡病因之一。在过去的十年中,随着影像学的进步以及健康体检的普及,越来越多的肝癌病人在患病早期被发现。但由于肝脏捐赠者的短缺,外科肝脏切除术仍然是治疗早期肝癌病人的最主要方法。本研究建立了一种预测早期肝癌病人术后复发的模型。

研究思路

1. CpG位点选择
研究者首先采用焦磷酸测序技术验证了450k芯片数据的再现性。通过分析66例病人的FFPE样本和新鲜冷冻组织样本发现,随机选择的两个CpG位点甲基化水平呈现出高度的一致性。采用△β>0.15,FDR<0.01和p value<0.01这一标准,过滤450K芯片结果,得到2550个差异CpG位点。随后,研究者为了区分高风险和低风险的病人,采用LASSO和SVM-RFE算法分别得到了30个差异最显著的CpG位点。

2. 探究可预测的标签
通过比较两种算法得到的CpG位点,发现有14种是同时被鉴定出的,46种是不同的。通过分析46种不同CpG位点,把66例样本分成复发和不复发两个亚类。研究者随后采用Cox回归模型在训练组中进一步缩小了E-HCC病人的甲基化检测位点。结果发现,cg20657849(SCAND3), cg19406367(SGIP1), 和 cg19931348(PI3)三个甲基化位点与E-HCC病人复发高度相关。
随后研究者采用焦磷酸测序技术,分别在训练组和鉴定组中量化这一发现。为了更好的研究这三个CpG位点用来预测E-HCC复发的准确性,在训练组中设定了一种危险系数评分。(risk score = (0.104 ×SGIP1甲基化水平) + (-1.125 ×SCAND3甲基化水平) + (-0.085 × PI3甲基化水平))研究发现,-0.401为risk score阈值。

3. 证实这一标签
为了证实这一模型的稳定性,研究者分别在一组内部样本和两组外部样本进行了检测。在内部样本中,该模型成功的分类了68例复发高风险病人,73例低复发风险病人。在外部样本中,同样成功分类了高风险和低风险病人。ROC分析发现,MSEH预测早期肝癌病人复发比三个CpG位点单独检测更有效。

4. 建立可预测的诺模图
为了建立临床上适用的用来预测个体复发的模型,综合考虑了协变量后,研究者用诺模图建立了可以用来预测的模型。基于RFS的多变量分析,研究者生成了一个诺模图预测患者的5年生存率,通过三个校正点的检测均得到理想结果。
本文通过分析早期肝癌患者甲基化芯片结果,得到三个与早期肝癌患者复发相关的CpG位点,并通过训练组和验证组优化了这一预测模式。最终,研究者建立了一种诺模图,用来预测早期肝癌患者的术后复发风险。

寻找早期肝癌预后模型——作者背后故事

在广州工作的一对堂兄弟,接连半年内相继发现肝癌,这对一个家庭来说打击巨大。不幸中的万幸,肿瘤都小,兄弟两诊断为早期肝癌。于是托了关系,找到知名教授手术,顺利的完成手术。但令人意外的是,同样接受根治性手术的早期肝癌,哥哥半年不到就复发了,庆幸的是弟弟一直没有问题。
这样的情况不仅仅出现在这对兄弟上,国内外研究均显示即使早期肝癌,根治术后复发率都是接近一半。到底是什么原因导致的兄弟两如此迥异的结局?这不仅困惑家属,也同样困扰着责任心极强的主刀大夫。分子生物学差异可能是背后的元凶,而如何在浩瀚如海的众多基因中寻找差异,一直制约着转化医学进一步发展。
高通量大数据的技术为上述问题的解决提供了有力工具。最近,中山大学等联合国内数家单位,借助上海国家生物工程中心的伯豪生物芯片有限责任公司平台,完成全基因组DNA甲基化高通量芯片检测,筛选出三个与肝癌复发的基因,这些基因能在多中心大样本良好的区分复发和未复发病人,相关结果发表在国际临床肿瘤学顶尖杂志journal of clinical oncolgy。该结果有望为早期肝癌患者提前预警,也为肝癌靶向治疗提供潜在作用靶点。

 

案例二:伯豪客户《Nature Communications》甲基化研究揭示鼻咽癌治疗新靶点

研究背景

在中国华南地区,鼻咽癌有较高的发病率。目前,鼻咽癌病人的治疗方案主要取决于病人的TNM分期。但是,约30%的鼻咽癌病人虽然处于相同的TNM分期,采用相同的治疗方案,其结果也不尽相同。表观层面的改变对于肿瘤起始和发展,发挥着重要的作用。目前,在鼻咽癌转移发生过程中表观的改变并不清楚,也没有预测模型精确的筛选出高转移风险的鼻咽癌病人。中山大学附属肿瘤医院的科学工作者,采用甲基化芯片在全基因组范围内鉴定了鼻咽癌病人特异的转录因子HOPX。该研究为鼻咽癌诊断提供了新的生物标记,为鼻咽癌的治疗提供了新的靶点。

研究结果

1. 鼻咽癌细胞中HOPX启动子区域高甲基化
研究者通过比较24例正常与24例鼻咽癌组织450K甲基化芯片结果,发现344个转录因子的1984个CpG位点甲基化有显著差异。分级聚类分析后,发现HOPX(cg21899596)在鼻咽癌中甲基化差异最为显著。随后,在8例正常与8例鼻咽癌患者中进行了焦磷酸测序验证。这一结果同样在鼻咽癌细胞系中得到了进一步证实。

2. 鼻咽癌中HOPX表达下调是由于启动子区高甲基化
在鼻咽癌组织和细胞系中,通过real-time PCR检测发现HOPX的表达显著低于正常组织和细胞。改变HOPX启动子区甲基化状态后,HOPX的表达显著升高。

3. HOPX在体外抑制鼻咽癌细胞系迁移和侵袭
在鼻咽癌细胞系中过表达HOPX后,鼻咽癌细胞的迁移和侵袭被显著的抑制,而细胞的生长并没有被影响。

4. HOPX抑制鼻咽癌细胞的EMT过程
在N2-Tert,,NP69 和SH cells敲低HOPX后,细胞形态发生显著变化。SUNE1细胞系中过表达HOPX后,检测发现ECADHERIN显著上调。

5. 鼻咽癌细胞中HOPX抑制SNAIL转录
由于EMT-TFs在EMT过程中起着重要的角色,研究者检测了HOPX表达改变后已知的EMT-TFs调节者(SNAIL,SLUG, ZEB1, ZEB2, TWIST1 和 FOXC2)的变化。HOPX表达量改变后,只有SNAIL有显著的变化。研究发现,HOPX可以与SNAIL的启动子区结合。

6. HOPX通过募集HDAC2抑制SNAIL的转录
免疫共沉淀研究发现,在生理状态下HDAC2与HOPX结合。HOPX与HDAC2结合后,更多的HDAC2募集在SNAIL的启动子区,抑制SNAIL的转录。

7. HOPX抑制SNAIL转录是SRF依赖的
通过检测SNAIL结合HOPX的启动子区序列,发现了一个血清效应因子应答元件SRF。在之前的研究中,发现SRF可以与HOPX结合。在鼻咽癌细胞系CNE2和SUNE1细胞系中,过表达SRF显著提高了SNAIL转录并降低了ECADHERIN的转录。CoIP实验验证了在生理状态下HOPX与SRF的结合。HOPX在SRE突变的体系中,并不能影响SNAIL的转录。HOPX与SRF共表达的情况下,能够显著抑制SNAIL的转录。因此,HOPX通过募集HDAC2抑制SRF依赖的SNAIL转录。

8. 恢复SNAIL的表达能够抵消HOPX对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的抑制
在鼻咽癌细胞中过表达SNAIL后,显著的削弱了HOPX对鼻咽癌细胞的迁移和侵袭的抑制,而且ECADHERIN的表达降低,VIMENTIN的表达升高。

9. 在活体动物体内HOPX抑制鼻咽癌细胞的恶性进程
在小鼠腹股沟淋巴结转移模型内,过表达HOPX抑制鼻咽癌细胞的转移。免疫组化结果也证实在动物体内和临床组织内,HOPX抑制SNAIL的表达,进而抑制鼻咽癌的恶性进程。

10. HOPX增加鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性
在小鼠移植瘤模型内,HOPX过表达显著提高了顺铂对肿瘤的抑制作用。

11. HOPX的甲基化程度与鼻咽癌病人的生存率密切相关
为了检测HOPX的甲基化是否与鼻咽癌病人的临床生存率相关,研究者采用焦磷酸测序检测了443例鼻咽癌病人的组织。在训练组中72.5%(185/255)HOPX高甲基化。在验证组中,59%的鼻咽癌病人HOPX高甲基化并伴随着较短的生存期。

研究结论

鼻咽癌病人中HOPX启动子区高甲基化导致的其表达量降低,促进了鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。这一生物学进程是由于HOPX在生物体内与HDAC2结合,能够抑制SRF依赖的SNAIL的转录。HOPX的甲基化程度与临床鼻咽癌病人的生存率高度相关。这一研究结果为鼻咽癌病人的恶性诊断提供了重要依据,丰富了鼻咽癌的治疗靶点。